1　材料 
　　款冬藥材采自河北蔚縣款冬種植基地，分別采集2009年9月3日，10月1日，11月5日，12月3日及2010年3月4日的款冬花，陰干備用。經山西大學中醫(yī)藥現代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為菊科植物款冬T　farfara，樣品現保存于山西大學中醫(yī)藥現代研究中心。 
　　甲醇（天津市登峰化學試劑廠，批號20110725272，純度　995%），三氯甲烷（天津市風船化學試劑有限公司，批號20090223，純度　990%），娃哈哈純凈水，二十四烷（AlfaAesar，　純度>990%，　批號F14S034），MSTFA+1%TMCS?。≒ierce　Chemical　Company，　USA，批號101043355），正庚烷（天津市光復精細化工研究所，批號NK20402000，純度　995%），甲氧胺（上海晶純試劑有限公司，批號11190，純度　985%）。 
　　Trace　PolarisQ氣相色譜質譜聯用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur12數據處理系統美國Thermo　Finnigan公司）；　LD5001電子天平?。ㄉ蜿桚堯v電子有限公司）；101系列恒溫干燥箱　（北京和同創(chuàng)業(yè)科技有限責任公司）；RE52A旋轉蒸發(fā)器?。ㄉ虾啒s生化儀器廠）。 
　　2　方法 
　　21　樣品制備 
　　將款冬花樣品液氮研磨至粉末，稱取樣品30　mg于10　mL玻璃離心管中，加入CH3ClMeOHH2O?。?∶1∶1）　1　mL，聲提取30　min，3　000　r·min-1離心30　min，分為上層和下層。 
　　211　上層（甲醇水層極性部分）　取上清液250　μL，旋轉蒸干，殘渣加30　μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液（20　g·L-1），70　℃下反應1　h，冷卻至常溫后，加50　μL　MSTFA+1%TMCS，37　℃下反應30　min。后加入700　μL　正庚烷（含內標二十四烷01　g·L-1），轉移至GC進樣小瓶，渦旋1　min，045　μm微孔濾膜過濾，進行GCMS分析。 
　　212　下層（氯仿層非極性部分）　將所有氯仿層移至25　mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干，加入600　μL的硫酸甲醇溶液（5%），50　℃反應30　min，冷卻至室溫，加入200　μL水和200　μL正庚烷，振搖使分層，正庚烷層依次用200　μL碳酸氫鈉水溶液（5%）和200　μL的氯化鈉水溶液（5%）洗滌，正庚烷層加入無水*干燥24　h，之后將其移出旋轉蒸干，加入200　μL正庚烷（含內標二十四烷01　g·L-1），轉移至GC進樣小瓶，渦旋1　min，045　μm微孔濾膜過濾，進行GCMS分析。 
　　22 色譜條件 
　　221色譜柱　J&W　DB5MS毛細管柱（025　mm×30　m，025　μm）；進樣口溫度　280　℃；載氣（He）流速10　mL·min-1，不分流。 
　　222 甲醇水層升溫程序　50　℃保持1　min，以每分鐘10　℃升至190　℃，保持1　min；以每分鐘3　℃升至210　℃，保持1　min，后以每分鐘7　℃升至280　℃，保持5　min。溶劑延遲時間為4　min，進樣量1　μL。 
　　223　氯仿層升溫程序　50　℃保持2　min，以每分鐘15　℃升至160　℃，保持1　min；以每分鐘8　℃升至210　℃，保持1　min，后以每分鐘5　℃升至280　℃，保持5　min。溶劑延遲時間為5　min，進樣量2　μL。 
　　23　質譜條件 
　　電子轟擊（EI）離子源；電子能量70　eV；傳輸線溫度280　℃；離子源溫度200　℃；質量掃描范圍m/z　60～800。 
　　24　數據分析 
　　所有的GCMS原始數據通過GCMS儀器工作站軟件Xcalibur由RAW格式轉化為netCDF格式。GCMS圖譜經XCMS軟件預處理后（XCMS參數：fwhm75，　snthresh2，　max300，　group　bw10），導入Excel中對數據進行面歸一化，之后將歸一化的數據導入代謝組學軟件SIMCAP　110　軟件包（瑞典，　Umetrics　AB，　Umea），對數據進行ctr標準化之后進行主成分分析（principal　component　analysis，PCA）和偏小二乘法判別分析（partial　least　squares　discriminant　analysis，PLSDA），通過載荷圖（SPlot　loading圖）中的VIP（每個主成分變量對分開各組的貢獻大小）來尋找生物標志物，后通過標準質譜數據庫（NIST05）檢索匹配結合對照品對部分代謝物進行指認，并通過計算各個標志物的內標歸一化后的相對峰面積含量來進行定量分析，并且采用常規(guī)統計分析SPSS　115軟件進行方差分析，結果用±s表示，顯著性差異比較采用t檢驗。3　結果與分析 
　　31　代謝物的指認 
　　甲醇水層通過衍生化反應得到氨基酸，有機酸和糖類，其典型總離子流色譜圖見圖1；而氯仿層經過甲酯化得到的均為非極性小分子和脂肪酸類化合物，其典型總離子流色譜圖見圖2。氨基酸的指認是結合NIST05數據庫，再通過與對照品的保留時間和離子碎片對照而確定的，見圖3。目標峰在樣品色譜圖中的保留時間與標品的保留時間一致，而且離子碎片情況也基本一致，故確定其為天冬酰胺。其余色譜峰的結構指認方法同上，共指認出氨基酸11個，有機酸8個，糖類5個，脂肪酸10個和甾醇類化合物2個，此外還包括香橙烯及其他的一些長鏈烷烴類低極性化合物。 
　　圖5表明，散點圖上可以看出極性部分各個組與采收期在X軸上均能明顯分開，從Spslot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物。從圖中可以得到，在發(fā)育初期的9月，其磷酸、甘油、蘋果酸、檸檬酸、蔗糖和葡萄糖的含量較高，而發(fā)育中期的脯氨酸和賴氨酸的含量明顯升高；3月款冬樣品與采收期相比，開花后的脯氨酸、賴氨酸和蔗糖的含量降低，蘋果酸、檸檬酸、果糖和葡萄糖的含量則呈升高的趨勢。 
　　2個不同采集月份與傳統采收期的款冬花蕾樣品相比得到的多元統計分析結果見圖6，散點圖上可以看出非極性部分發(fā)育初期和開花后與采收期10—12月份在X軸上均能明顯分開，從圖6中SPlot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物。與發(fā)育中期相比，在發(fā)育初期的9月，其棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸的含量較高，香橙烯、花生四烯酸和谷甾醇的含量較低；在開花后的3月，其亞油酸的含量降低而花生四烯酸和谷甾醇的含量升高。 
　　由以上標志代謝物的含量比較可以看出，差異主要體現在蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、賴氨酸、蘋果酸、檸檬酸、亞油酸、花生四烯酸和谷甾醇這9個共同的特征性差異代謝物含量上，故對其相對含量進行了t檢驗分析和比較，柱狀圖見圖7。從圖中可明顯看到，脯氨酸和賴氨酸在花蕾發(fā)育初期含量較低，隨著不斷生長發(fā)育逐漸升高，開花后急劇下降；蘋果酸和檸檬酸在發(fā)育初期較高，中期降低，開花后回升至接近初期水平；蔗糖的含量是呈逐漸下降趨勢，在開花后降到低；葡萄糖在發(fā)育初期含量較高，隨著生長其含量不斷下降至低，而在開花后又回升至較高水平；谷甾醇的含量從發(fā)育初期到開花后是逐漸升高的。亞油酸在發(fā)育初期較低，逐漸升至高，開花后顯著降低；而花生四烯酸則是呈相反的趨勢，12月份降至低，而在開花后升至高。 
　　4 討論 
　　崔貴梅等[8]曾對款冬花序芽的分化過程進行了觀察，結果表明款冬從7月上旬至10月初經歷花芽分化，因為花芽分化意味著植物從營養(yǎng)生長轉向 生長，因此款冬花在越冬前后一定有營養(yǎng)積累和轉化的過程。蔗糖是高等植物光合作用的主要產物，是多數植物體內運輸碳水化合物的主要形式，為植物的生長發(fā)育提供物質和能量?？疃谖闯鐾恋陌l(fā)育初期9月到出土開花后的3月，蔗糖逐漸轉化為其它營養(yǎng)和能量物質，其含量隨著花蕾的發(fā)育逐漸降低。有機酸中的檸檬酸和蘋果酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產物，其含量在發(fā)育初期高，發(fā)育中期急劇降低，其含量降低的原因可能在于花蕾的發(fā)育中期需要的能量，有機酸轉化為糖類為花蕾的發(fā)育提供能量。在花蕾發(fā)育中期，可能由于所需能量較多，葡萄糖也參與到能量供應中，通過糖酵解使其發(fā)生氧化而減少。氨基酸屬于植物中的一大類初生代謝產物，生物體內氨基酸的主要作用是合成蛋白質或其他含氮化合物，在植物體內，特別是當種子萌發(fā)時，蛋白質發(fā)生強烈的降解作用，產生的氨基酸被重新利用形成幼苗中的蛋白質。故在本實驗中，款冬花蕾樣品中脯氨酸和賴氨酸初期含量較低，而后逐漸累積升至高，在開花后又急劇下降，可能是由于在花蕾的生長發(fā)育初期蛋白質分解轉化為氨基酸，故氨基酸逐漸增多，中期含量升至高，開花后由于能量需求降低氨基酸則又合成為蛋白質，故其含量急劇降低。除此之外，脂肪酸也是一類重要的能量物質，亞油酸在花蕾發(fā)育過程中是呈先升高后降低的趨勢，而花生四烯酸則是相反的趨勢，其變化的機制尚不明確。 
　　由于款冬花中次生代謝產物含量相對于初級代謝產物要低很多，而且NIST數據庫中收載的僅為常見化合物的質譜數據，因此本實驗中解析的化合物均為初級代謝產物，下一步將會采用傳統的植化方法對款冬花中次生代謝產物進行系統分離，進而通過得到的次生代謝產物對照品進一步指認款冬花中的次生代謝產物。 
　　本草記載中款冬花為花蕾未開花時根據經驗方可采收，并未明確指出具體采收時期，目前尚沒有科學的依據來做指導，導致市場上款冬花蕾質量參差不齊。本研究從化學的角度闡明10月、11月、12月的代謝組成相近，但合理的采收期還需要通過藥效試驗以及分析不同產地以及不同年份種植的樣品進一步研究確定。 
　　通常認為，中藥的活性成分為次生代謝產物，其質量評價指標也多為次生代謝產物。如2010年版《中國藥典》中規(guī)定，以款冬酮的含量評價款冬花的質量。然而，中藥中還存在著的初級代謝產物，如氨基酸、糖類、有機酸和脂肪酸等。此外，按照中醫(yī)傳統，中藥多以水煎入藥，在煎出次生代謝產物的同時，初級代謝產物也被煎出。款冬中的初級代謝產物雖然沒有直接的止咳化痰作用，但是近有研究[15]報道，一些氨基酸、有機酸和糖類可能作為天然低共溶溶劑（natural　deep　eutectic　solvents，NADES）存在于生物細胞，被認為是細胞中的第3種液體，即天然離子液體。而植物細胞中包含的次級代謝產物屬于中等極性的化合物，如蘆丁、槲皮素等，其高濃度時既不溶于水也不溶于脂類（細胞膜），而該研究發(fā)現蘆丁在NADES中的溶解度是水中的50～100倍。因此，可能作為細胞內天然離子液體的這些初級代謝產物，其含量與次生代謝產物的含量有著密切的關系。此外，這些初級代謝產物在中藥內存在，其組成變化直接影響中藥的均一性，因此，這些化合物的含量雖然與中藥的有效性無直接關系，但對于中藥的均一性控制非常重要。中藥的作用特點為多成分多靶點協同作用，這些初生代謝產物對于藥效發(fā)揮的協同作用值得進一步研究。